在題為“Advanced Alzheimer’s Disease Models Using iPSC?derived Microglia and Neurons Harboring Disease?related Gene Variants"的海報中，Shatri等人(1)使用CRISPR/Cas?9技術在人體iPSC中引入與癡呆相關的突變，并將其分化為微膠質細胞。在野生型細胞系的基礎上，研究人員還構建了七種不同的突變細胞系：APOE2/2、APOE3/3、APOE4/4、APOE基因敲除、TREM2R47H、GRN+/?以及GRN基因敲除。

APOE基因(載脂蛋白E)具有2、3和4三種等位基因，它們分別對應不同的阿爾茨海默病風險水平。其中，APOE4/4與最高的患病風險相關，而APOE2/2則被認為具有神經保護作用(2)。 此外，在TREM2基因(髓系細胞觸發受體2)中攜帶特定的TREM2R47H突變的人群，其罹患阿爾茨海默病的風險也顯著升高(3) 。GRN基因(顆粒蛋白)功能缺失突變主要與額顳葉變性(FTLD)相關，但也可能在阿爾茨海默病中發揮作用(4)。

在獲得這些細胞系后，研究人員通過檢測經典微膠質細胞標志物來進行驗證。免疫染色結果顯示，所有編輯后的細胞系均穩定表達IBA?1、TMEM119、TREM2和P2Y12R，這表明其微膠質細胞特性得以保持。同時，還對突變基因在這些細胞系中的表達水平進行了定量分析。該驗證結果證明，這一模型在遺傳背景上準確可靠，并且在表型上確實屬于微膠質細胞，為后續功能研究奠定了基礎。

作者在不同細胞系中檢測了細胞因子的釋放情況，這些細胞在受到病理性刺激或免疫激活因子處理后產生反應。病理性刺激包括StressMarq公司的β淀粉樣蛋白1?42預形成纖維(貨號SPR?487)和β淀粉樣蛋白1?42寡聚體(貨號SPR?488)；免疫激活因子包括IFN?γ、LPS和TNF?α。

圖1：[圖片來源：StressMarq]透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示了β淀粉樣蛋白1?42單體(貨號SPR?485，左)、β淀粉樣蛋白1?42寡聚體(貨號SPR?488，中)以及β淀粉樣蛋白1?42預形成纖維(貨號SPR?487，右)。

隨后，研究人員通過細胞因子的釋放水平評估各細胞系對免疫刺激的響應能力。值得注意的是，在IFN?γ處理后，APOE2/2型微膠質細胞釋放的IL?6顯著高于其他APOE基因型以及APOE敲除細胞。這一結果表明，APOE等位基因狀態會調節微膠質細胞對細胞因子刺激的炎癥敏感性。

在野生型微膠質細胞中，β淀粉樣蛋白寡聚體可誘導IL?6、IL?18和TNF?α水平升高。有趣的是，這種效應在β淀粉樣蛋白纖維處理時并未觀察到，這與寡聚體在誘導炎癥反應方面具有更高生物活性的觀點一致。

關鍵的是，TREM2R47H突變的微膠質細胞在面對β淀粉樣蛋白寡聚體時，并未產生相同水平的細胞因子反應，這表明這一與阿爾茨海默病相關的TREM2變異可能削弱或改變了微膠質細胞對寡聚體β淀粉樣蛋白的識別或信號傳導過程。此外，研究人員還通過給予不同梯度劑量的IFN?γ、TNF?α和LPS，測定了各細胞系的劑量依賴性響應。

吞噬能力是微膠質細胞的一項關鍵功能，與清除β淀粉樣蛋白密切相關。研究人員使用結合了pHrodo染料的β淀粉樣蛋白寡聚體和大腸桿菌顆粒，對不同APOE基因型的吞噬過程進行了實時監測。pHrodo是一種在酸性環境(如吞噬體內部)中熒光增強的染料，因此非常適合用于追蹤吞噬過程。

研究結果顯示，與APOE4/4和APOE敲除細胞相比，APOE3/3微膠質細胞對β淀粉樣蛋白寡聚體的攝取更高，這表明APOE基因型會影響微膠質細胞內化寡聚體β淀粉樣蛋白的能力。鑒于APOE4與更高的阿爾茨海默病風險密切相關，APOE4型微膠質細胞在清除寡聚體方面吞噬能力降低，可能是其致病作用的功能性原因之一。不過，盡管存在遺傳差異，所有細胞系仍保留了吞噬細菌顆粒和β淀粉樣蛋白的基本能力，這說明基因型主要影響的是吞噬效率，而非完-全喪失該功能。

為了提高模型的生理相關性，研究團隊在現有基礎上改進了共培養方案，將NGN2誘導的神經元與來源于iPSC的微膠質細胞共同培養。免疫染色結果證實，在共培養體系中既存在神經元標志物(β?Tubulin、MAP2)，也存在微膠質細胞標志物(IBA?1、TREM2、TMEM119)，從而可以在神經元信號存在的條件下研究微膠質細胞的反應，并對細胞間相互作用進行動態觀察。