在觀察到ADLumin-1在淀粉樣β纖維存在時(shí)化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)后，Zhu等人確定，ADLumin-1是沿β-折疊纖維的長軸，與其內(nèi)部的疏水性口袋發(fā)生結(jié)合。這種結(jié)合方式與ThT類似。基于這些發(fā)現(xiàn)，Zhu等人假設(shè)ADLumin-1可以作為一種針對β-折疊結(jié)構(gòu)的通用探針。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，他們使用了模型肽PA-K2和PA-E2——這兩種肽可形成β-折疊纖維(富含Val/Ala)。此外，他們還使用了肽PA-K和PA-E，這兩種肽也能組裝成纖維，但不具有大量β-折疊結(jié)構(gòu)。

研究人員表明，與背景相比，ADLumin-1在PA-K2存在下的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)了4,168倍；而在PA-K中僅約為248倍，對應(yīng)強(qiáng)度比為16.8。與ThT相比，在PS-K2孵育條件下，ADLumin-1的信噪比比硫代黃素T高127.7倍。在PA-E/PA-E2肽中也得到了類似結(jié)果。在證明了ADLumin-1能夠以高于ThT的靈敏度特異且穩(wěn)定地結(jié)合β-折疊結(jié)構(gòu)之后，研究人員決定將其與一系列與疾病相關(guān)的misfoldon進(jìn)行測試。

將其分別與StressMarq的Tau(K18)P301L突變體預(yù)制原纖維(目錄號 SPR-330，StressMarq產(chǎn)品可通過中國總代理商欣博盛生物購買)、α-突觸核蛋白、淀粉樣β以及TDP-43纖維混合后，均檢測到了強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光信號，其信噪比優(yōu)于ThT。與ThT相比，ADLumin-1使α-突觸核蛋白的信噪比提高了83倍，淀粉樣β提高了75倍，tau提高了15倍，TDP-43提高了11倍。此外，ADLumin-1還能夠區(qū)分單體與纖維，并能夠檢測寡聚體。不同misfoldon之間信號衰減半衰期的差異表明，ADLumin-1有可能用于區(qū)分它們。分子對接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，ADLumin-1沿β-折疊纖維的長軸結(jié)合，并與由Ala、Val、Ile和Phe形成的疏水通道發(fā)生作用，這種對接方式解釋了其對多種靶標(biāo)的廣泛適用性。

圖1.［引自 StressMarq 網(wǎng)站］Tau(K18)P301L突變體預(yù)制原纖維(PFFs)(目錄號：SPR-330)的透射電子顯微鏡(TEM)圖像

Tau是與阿爾茨海默病(AD)密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，它會在患者大腦中聚集并形成纏結(jié)。在對AD患者腦切片進(jìn)行染色時(shí)，ADLumin-1能夠與抗Tau抗體實(shí)現(xiàn)共定位。在野生型(WT)和tau P301突變小鼠中，注射ADLumin-1后，利用動物成像系統(tǒng)在不同時(shí)間點(diǎn)記錄化學(xué)發(fā)光信號。在突變型與WT小鼠之間觀察到了顯著的化學(xué)發(fā)光差異。這兩項(xiàng)關(guān)于Tau的研究均表明，ADLumin-1能夠在體內(nèi)有效檢測Tau纏結(jié)。

在肌萎-縮側(cè)索硬化癥(ALS)中，TDP-43會在大腦和脊髓的運(yùn)動神經(jīng)元中發(fā)生聚集。在對野生型和A315T轉(zhuǎn)基因小鼠(ALS模型)進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)靜脈注射探針后，A315T小鼠的信號高于WT小鼠。在A315T小鼠切片中，ADLumin-1檢測到了包涵體，并通過與抗體的共定位得到了驗(yàn)證。

在帕金森病(PD)中，α-突觸核蛋白的聚集起核心作用，會形成具有毒性的寡聚體和纖維。因此，無論在體外還是體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對α-突觸核蛋白的可靠檢測，對于PD研究都具有重要意義。Zhu等人能夠以飛摩爾級別的靈敏度檢測α-突觸核蛋白，優(yōu)于ThT。通過結(jié)合蛋白錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA)和“種子"誘導(dǎo)方法，他們成功在腦脊液(CSF)中檢測到α-突觸核蛋白。這一檢測為其在體外診斷中的應(yīng)用提供了可能。重要的是，ADLumin-1同樣能夠在PD患者腦組織中檢測到α-突觸核蛋白，這一點(diǎn)至關(guān)重要，因?yàn)樗型麘?yīng)用于腦組織的死后分析。

在研究人員開展的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將α-突觸核蛋白聚集體經(jīng)顱內(nèi)注射至小鼠，并用ADLumin-1進(jìn)行標(biāo)記。隨后，他們采用三維彌散發(fā)光成像斷層技術(shù)(DLIT)。該技術(shù)僅在接種部位檢測到局部化學(xué)發(fā)光信號，從而證實(shí)了對腦深部α-突觸核蛋白的選擇性檢測。在腹腔注射ADLumin-1后，過表達(dá)人α-突觸核蛋白的轉(zhuǎn)基因A53T小鼠，其腦部信號較野生型高出2.1倍。在4至12個(gè)月的縱向分析中，A53T與WT小鼠之間的信號比上升至2.6倍，與疾病進(jìn)展趨勢相一致。隨后，研究人員通過離體組織學(xué)染色驗(yàn)證了α-突觸核蛋白的積累。

在確認(rèn)ADLumin-1能夠在體內(nèi)追蹤α-突觸核蛋白傳播后，研究人員進(jìn)一步開發(fā)了一種方法，以同時(shí)增強(qiáng)信號并實(shí)現(xiàn)對α-突觸核蛋白的選擇性成像。他們采用了一種生物正交的化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(ChRET)技術(shù)，將作為化學(xué)發(fā)光供體的ADLumin-1與熒光受體配對。該受體可特異性結(jié)合α-突觸核蛋白(CRANAD-14)。采用該方法，可在活體轉(zhuǎn)基因A53T小鼠腦中實(shí)現(xiàn)對α-突觸核蛋白的精確成像，并能夠與阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型(5xFAD)中的錯(cuò)誤折疊淀粉樣β加以區(qū)分。